改进间断口服二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的建立

党春艳1,王军2 ,张力△[]

（1.承德医学院附属医院肿瘤放化疗科，河北 承德 067000；2. 承德医学院附属医院病理科，河北 承德 067000）

[摘要] 目的 采用改进的间断口服二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine DEN），以建立诱癌成功率高及低死亡率的大鼠肝癌模型。方法 将55只雄性Spraque-Dawley（SD)大鼠随机分成实验组（n=40只）和对照组（n=15只）。实验组自由饮用0.01% DEN溶液6周，停药2周，期间正常饮水，继续喂药6周后停止用药，接着正常饮水2周。对照组常规饮水。于处理后第4、8、12及16周末称得两组大鼠体重及肝脏质量，计算肝脏指数。观察肝脏大体形态及病理学变化。结果 对照组与实验组大鼠体重及肝脏指数有显著差异（p<0.05）。实验组大鼠16周末成癌率达100%（15/15），总体死亡率为17.5%（7/40）。实验组大鼠第4周末表现为肝脏炎症；第8周末表现为肝脏纤维化-硬化；第12周末表现为肝细胞不典型增生；第16周末形成肝细胞癌。结论 改进的方法具有操作简单、造模周期短、诱癌率高及死亡率低等特点，可以为动态研究人类肝癌的发生发展提供理想的动物模型。

[关键词] 大鼠；二乙基亚硝胺；肝癌；动物模型

Establishment of a liver cancer model induced by modified oral diethylnitrosamine discontinuously in rats

Chun-yan Dang1 , Jun Wang2 , Li Zhang△1

1. Department of Radiochemotherapy oncology, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000,China；2. Department of Pathology, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000,China；

[ABSTRACT] Objective To establish a high success rate of carcinogenesis and a low mortality rate in the rat model of liver cancer by modified oral diethylnitrosamine discontinuously.Methods Fifty-five male Spraque-Dawley（SD) rats were randomly divided into the experimental group(40 rats) and the control group(15 rats).Rats of the experiment group were given 0.01% DEN solution in water for 6 weeks,followed by free drinking water for 2 weeks,and then continued drink 0.01% DEN solution in water for another 6 weeks. And the rats of control group were received free drinking water conventionally.Both experiment group and control group were sacrificed at the end of 4th,8th,12th and 16th week respectively.We got two groups of rats boby weight and liver weight, and observed the change of liver morphology and pathology. The liver mass index was calculated.Results The body weight and liver mass index were significantly different between the control group and the experimental group（p<0.05）.The carcinogenesis rate was 100%（15/15）at 16 weeks with an overall mortality was 17.5%（7/40）in the experiment group. Hepatit was showed on 4th week,hepatic fibrosis-cirrhosis was showed on 8th week,hepatocellular atypical hyperplasia was showed on 12th week and hepatocellular carcinoma was showed on 16th week in the experiment group.Conclusion This improved approach was simple and easy to operate, shortened the time of carcinogenesis, increased the rate of induced hepatocarcinoma and decreased the mortality of rats.The model can provide ideal animai model for the dynamically studying tumorigenesis of human liver cancer.

Key words: Rats；Diethylnitrosamine；Liver cancer；Animal models

   原发性肝癌是临床常见的恶性程度高、预后较差且死亡率高的肿瘤之一[1]。近些年来，肝癌的发病率呈逐年上升，且我国是高发地区[2]。肝癌的发生过程多数表现为肝炎-肝硬化-肝癌的轴性过程[3]，对于其具体的发病机制仍不明确。因此需要建立与人类肝癌发生过程十分相似的动物模型用作研究。二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine DEN）作为一种化学致癌物，因为其诱发的肝癌模型与人类肝癌患者的组织类型相似并且预后较差[4-5]。所以被广泛应用于建立诱发性肝癌的动物模型。本实验通过改进间断口服DEN诱发SD大鼠肝癌模型，以期建立高诱癌率、低死亡率的大鼠肝癌模型，为研究肝癌发生发展的机制提供理想的动物模型。

材料和方法

  1、材料

  1.1主要试剂 二乙基亚硝胺（0.95g/ml 纯度99.9%），购自美国Sigma公司。4%多聚甲醛购自北京索莱宝生物科技有限公司。水合氯醛购自北京索莱宝生物科技有限公司。

  1.2动物来源 清洁级雄性SD大鼠（SCXK（京）2012-0001），体重180-200g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2、方法

2.1 肝癌模型建立：所有大鼠购入后，每笼饲养5只，给予标准的光照及饲料，每周更换垫料。自购买到达日算起，1周后开始实验。55只大鼠采用计算机进行随机化分组，选取40只大鼠作为实验组，15只作为对照组。用无菌食用水配制0.01% DEN溶液，

配制时需穿着防护衣，戴橡胶手套及防护口罩，避光保存。实验组大鼠自由饮用0.01% DEN溶液6周，停药2周，期间正常饮水，继续喂药6周后停止用药，接着正常饮水2周。对照组自由饮水16周。每日定点观察大鼠精神状况、进食量、毛发变化及活动量等一般情况。

2.2 取材及处理：实验组于第4周末、8周末、12周末分别处死大鼠6只及第16周末处死大鼠15只，同时间点的对照组处死动物3只。使用生理盐水配制10%水合氯醛，采用腹腔注射麻醉动物。麻醉成功后，称得大鼠体重，放置于清洁手术台面，开腹，观察肝脏大体形态（包括大小、颜色、质地及有无结节等），完整分离肝脏，采集图像。称得肝脏质量，计算肝脏指数=肝脏重量/体重×100%。摘取部分肝或肝癌组织放置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理组织学改变。  

   3、统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件进行处理，实验中计量资料用平均值±标准差（x±s）表示，采用独立t检验统计学方法比较。p<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1、大鼠一般情况、死亡率及成癌率：整个实验周期中，对照组大鼠进食水量正常，体重增长快，喜动，毛发柔软有光泽，没有死亡。实验组大鼠在第4周开始出现进食量及饮水量减少，活动量下降。在8周末明显出现精神萎靡，活动迟滞，体毛发黄，没有光泽。体重缓慢增长甚至部分出现减轻。实验组大鼠总体死亡率为17.5%（7/40），死亡的时间主要在13-15周，死亡原因主要是腹水、肺部感染及腹腔多发转移灶。第16周末实验组大鼠肝脏肿物经光镜证实为肝细胞癌，成癌率达100%（15/15）。  

2、各组大鼠体重变化：整个实验周期中，对照组大鼠体重变化呈直线上升，增加幅度大。实验组大鼠体重增长幅度小，甚至在16周出现体重下降现象。分析两组大鼠各个时期的体重情况，实验组明显低于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。见表1、图1。

3、肝脏指数变化：实验组大鼠各个时期的肝脏指数高于对照组大鼠，差异有统计学意义（p<0.05）。实验组变化趋势为逐渐升高，而对照组几乎呈一条水平线。见表2、图2。

4、肝脏大体形态及病理观察：对照组大鼠肝脏肉眼观表面整洁光滑，呈淡红色，肝脏质地柔软，未见病变。光镜下肝细胞排列整齐，核大小一致分布于细胞中央。肝细胞索呈放射状围绕中央静脉，肝窦清晰可见。见图3A、4A；第4周末实验组大鼠肝脏略显肿胀，部分肝被膜可见少量黄色渗出，质地中等。未见结节灶。光镜下肝小叶结构基本完整，部分肝细胞水肿样变性，伴不同程度的脂肪变性。小叶内可见点状坏死并伴有炎性细胞浸润。见图3B、4B；第8周末大鼠整个肝脏肿胀，边缘变钝，色泽发暗，质地韧，可见少量的灰白色圆形小结节。光镜下出现纤维组织增生及肝细胞再生，肝小叶结构失去完整性，假小叶形成，假小叶内肝细胞索排列紊乱。见图3C、4C；

第12周末大鼠肝脏表面粗糙，出现数量不等的灰白色结节，色泽晦暗，质硬。镜下肝脏中央静脉周围坏死加重，见嗜酸性细胞增生灶，并形成肝细胞结节，结节内肝细胞出现不典型增生明显。见图3D、4D；第16周末大鼠肝脏表面凹凸不平，表面布满大小不一结节，并且可见白色癌性肿块突出表面，部分伴出血、坏死。镜检组织学类型为肝细胞癌，癌细胞大小不均匀，异型性明显，排列成巢状或索状向周围组织浸润。见图3E、4E。

表1 两组各个时期体重比较(±SD，g)

体重（g）

  4周8周12周16周

对照组408.50±9.20510.97±19.64579.03±10.35626.37±24.78

实验组299.10±20.69337.13±9.08349.20±17.08338.97±16.11

P值0.000.000.000.00

   表2 两组各个时期肝脏指数比较(±SD，%)            

肝脏指数（%）

  4周8周12周16周

对照组3.83±0.253.97±0.153.83±0.123.83±0.15

实验组6.12±0.436.38±0.377.27±0.298.03±0.20

 P值0.000.000.000.00

  图3 肝脏大体外观 3A:正常肝脏 3B:诱癌第4周，肝被膜可见少量黄色渗出。3C:诱癌第8周，肝脏肿胀，色泽发暗，质地韧。3D:诱癌第12周，呈明显结节样改变。3E:诱癌第16周，癌结节形成，伴出血。

  图4 肝脏组织病理学（HE×100）4A:正常肝组织 4B:肝细胞水肿、脂肪变性，伴炎性细胞浸润。4C:纤维组织增生，假小叶形成。4D:可见肝细胞结节，结节内肝细胞不典型增生明显。4E:形成肝细胞癌，癌细胞大小不均匀，异性型明显。

讨论

实验用鼠在生理及分子结构上有着与人类高度相似的方面，通过干预可以比较准确地模拟癌症的发生过程[6]，因此被应用于建立动物癌症模型。动物模型是研究肝癌发病机制的重要工具，构建模型的方法有诱发性、自发性及移植性肝癌模型等。由于可以人为地控制诱癌剂的用法及实验条件，且诱癌成功率高，更加接近人类肝癌的发病过程，因此诱发性肝癌模型应用较广泛。此模型多选用纯系大鼠，鼠龄和性别对诱癌率的高低有直接关系。一般选取鼠龄在3个月以内，体重200g以下，体重较大则不易诱发肝癌[7]。在大鼠性别上的选择，认为雄性大鼠比雌性更容易诱癌成功，如Nakatani等提示了雄性激素在大鼠肝癌形成过程中的重要作用[8]。诱发性动物肝癌模型是指采用化学、物理或生物的致癌因素作用于动物而发生的肝癌[9]。其中以化学药物诱发肝癌较为常见，常用的药物有DEN、黄曲霉素B1（AFB1）及二甲基偶氮苯（DAB）等。DEN是一种强烈的化学致癌剂，对肿瘤的发生具有启动和促进的双重作用[10]。其对肝脏有着明显的亲和力，整个诱癌过程大致经历了肝炎、肝硬化直至肝癌形成，与人类肝癌的发生过程十分相似[11]。常用的DEN造模方法有自由饮水、灌胃及腹腔注射等，前者操作简单，但药物剂量不能准确控制。灌胃法操作复杂，且建模时间不短[12-13]，长期、反复的操作对大鼠机体有损害，易并发口腔和消化道感染。周陈杰等[14]采用腹腔注射DEN，14周以后肝癌发生率为75%（6/8），总体死亡率33%（10/30）。既往的DEN饮水诱癌法，多采用小剂量连续给药，成模周期长，有些甚至超过1年[15]，且诱癌死亡率较高[16]。李彦等[17]采用间断口服0.01%DEN溶液18周，诱癌率100%，死亡率30%(10/30)。76ppm剂量DEN间歇喂养大鼠，20周成癌率达到80%，总体死亡率22%（11/50）[18]。本实验参照传统方法，设立间歇期，并改进停药时机和诱癌周期，成功建立了诱发性肝癌模型。有以下优点：一、整个诱癌过程，大致经历了肝炎-肝硬化-肝癌，与人类肝癌发生发展过程十分相似。二、形成的肝癌病理类型为肝细胞癌，与人类肝癌的病理形态相似。三、诱癌周期为16周，且诱癌成功率高、死亡率较低。四、模型建立简单易重复，且足够成熟，实验费用合理。因此本模型是一种比较理想的研究肝癌发生发展机制的动物模型。

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△通讯作者：张力（1972～），男，主任医师，硕士，主要从事临床肿瘤的放化疗研究 ，邮编：067000