文黛薇1  胡展瑞1  莫湘1  黄大荣1 邓燕玲1 朱展田2 廖民霞1 刘成海3伍参荣3

1梧州市中医医院 （广西  梧州  543002 )

2广西中医药大学2012年硕士研究生

3 上海中医药大学教授

摘要：目的：探讨慢乙肝患者HBV基因型与中医辨证分型的相关性。方法:选择我院HBV感染的慢乙肝患者110例，进行中医辨证分型，对HBV DNA进行基因型检测，分析HBV基因型与中医辨证分型之间的相关性。结果：HBV的基因型与临床的辩证分型具有相关性（列联系数C=0.389，P＜0. 01），其中湿热中阻90.24%（37/41）、肝郁脾虚85.19%(23/27)、脾肾阳虚61.90%（13/21）主要以B基因型为主，瘀血阻络55.56%(5/9)则以C基因型为主。结论：广西梧州地区感染HBV，基因B型明显高于其他型；HBV基因型与中医证型有部分相关性，临床治疗CHB应以辨证论治为主，以基因分型为参考依据。

关键词：肝炎乙肝病毒基因分型证侯类型

Correlating HBV Genotypes with TCM Syndrome Differentiation

in Chronic Hepatitis B Patients of wuzhou guangxi

WEN dai-wei,MO xiang,HU zhan-rui,Huang da-rong DENG yan-ling,LIAO min-xia

Wuzhou City Hospital of traditional Chinese Medicine 543002

Abstract：Objective：Correlating HBV Genotypes with TCM  Syndrome Differentiation  in Chronic Hepatitis B Patients. Methods：Selecting 110 cases of CHB patients TCM  syndrome to differentiate and DNA genetic type was made to correlate HBV Genotypes with TCM  syndrome differentiation. Results：The genotype of HBV is correlated with TCM  Syndrome Differentiation (C=0.389，P< 0.01). In heat resistance 90.24% (37/41) and stomach type 85.19% (23/27) and deficiency of spleen and kidney 61.54% (8/13) Mainly in the B genotype；Qi stagnation and blood stasis type(55.56% 5/9) Mainly in the C genotype . Conclusions：HBV genotype C is more prevalent than the other genotypes patients of wuzhou guangxi with HBV infection.There is part relationship between HBV genotypes and TCM differentiating syndromes of CHB.The clinical treatment of CHB should be based on syndrome differentiation and treatment, with the reference of the genotype.

   Keywords：hepatitis B virus  Genotyped   TCM  typification

   HBV感染在世界各地均有不同程度的流行，但地区差异非常明显。国家间和国内地区间流行程度的差异，除与卫生状况、生活习惯、人体免疫遗传特征等因素明显相关外，也与病毒本身生物学特性(基因型、血清亚型、基因变异等)有关。依照感染人类HBV全基因系统进化的分析结果，可将HBV分为8个基因型(A-H)^[1]。近年来，HBV基因分型在HBV基础研究、分子流行病学研究和临床诊治方面应用广泛。HBV基因型序列数据可用来寻找和追踪传染源、分析病毒进化史，进行血清亚型分析。很多研究指出不同基因型可能有不同致病性。因此研究HBV基因型对慢性乙肝患者的临床和病毒学的影响有非常重要的意义。广西梧州地区属于HBV高度流行地区，本研究拟从分子水平研究该地区慢性HBV基因型的流行情况，揭示慢性HBV基因型与中医发病证侯类型的关系，以期在中医基础理论的指导下，探讨梧州地区基因型慢性乙型肝炎的中医证候学规律，从而为确定适合梧州地区慢性乙型肝炎患者的最佳治疗措施提供一定的依据。为该地区乙肝防控、西医诊治及中医诊治提供一定的科学依据。

1资料与方法

1.1.1病例来源  纳入研究对象的110例患者均为本院2012年12 -2015年6月我院门诊或住院患者，其中男76例，女34例，男女比2. 3 ：1，年龄最小15岁，最大67岁，平均(33. 6士18. 31)岁。病情分布为:慢性乙型肝炎轻度52例，慢性乙型肝炎中度31例，慢性乙型肝炎重度27例。

1. 1.2诊断标准  西医诊断标准:根据慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)^[2]中慢性乙型肝炎诊断标准选择病例。所有病例采用全血细胞分析仪检测血常规、血清丙氨酸转氨酶( ALT)、 天门冬氨酸转氨酶(AST)、 总胆红素 ( TB I L)、 白蛋白 ( ALB )、 白/球比值(A /G) ，肝脏 B超检查，采用 ELI SA法检测乙肝抗原抗体 5项指标,荧光定量 PCR法检测乙肝病毒 DNA定量 ( HBV DNA )。符合上述标准的 CHB患者 110例，为我院住院及门诊患者；病情分度：轻度，中度，重度。采取开放平行对照法。

1.1.3中医辨证标准:参照1992年中国中医药学会内科分会肝病专业委员会制定的《病毒性肝炎中医辨证标准》^[3]，将慢性病毒性肝炎分为五型:湿热中阻型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、瘀血阻络型和脾肾阳虚型。

1.1.4纳入标准:(1 )符合慢性病毒性乙型肝炎西医诊断标准;(2)年龄5 -70岁，性别、民族不限;(3)病程长短不限;(4)病历记录完整的门诊及住院患者。

1.1.5排除标准:(1 )不符合慢性病毒性乙型肝炎西医诊断标准者;(2)年龄不满5岁或年龄超过70岁，不能很好叙述病史、症状者;(3)同时患有其他肝病或肥胖症者;(4)西医诊断为慢性病毒乙型肝炎，但中医诊断不属于五型之一者;(5)病历记录不完整者。

1. 2方法

1.2.1中医辨证分型  由我院3名梧州市名中医组成中医辨证分型专家组对入选的110例入选病例进行中医辨证分型，将110例入选患者按辨证分型结果分为湿热中阻型组、肝郁脾虚型组、肝肾阴虚型组、瘀血阻络型组和脾肾阳虚型组五组。

1.2.2乙肝病毒基因分型方法

实验样本：共110例待测血清样本来自于梧州市中医医院。

检测项目：取HBV阳性患者阳性血清采用多引物对巢式PCR法检测HBV基因型；

1.2.3 试剂

5 MU/L Taq DNA合成酶； 10mM d NTP；100 bp DNAMarker(大连人宝生物工程有限公司)。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2..4仪器：

美国Bio-Rad-CFX960，美国Bio-Rad公司Gel Doc 2000 凝胶电泳成像分析系统。

1.2.5HBV 基因型检测

用基因型特异多引物对巢式PCR法

引物设计

根据HBV DNA pre-S和S基因区保守序列设计各HBV基因型特异引物。

(1)取100μl血清直接100℃煮沸10分钟，然后15000r/min离心10分钟，提取上清液备用。

(2)第一轮PCR反应体系25μl: ddH2O 16.25μl，10×TapBuffer 2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，25mM MgCl2 1.5μl，浓度为10μmol/L的正义、反义引物各1μl，5MU/L TaqDNA聚合酶0.25μl，，HBV DNA模板2μl。反应参数为:94℃预变性5分钟，然后94℃30秒，52℃30秒，72℃45秒共30个循环，最后72℃延伸5分钟。

1.2.6 PCR的检测：采用PCR-序列分析法

1.2.7引物设计

检索GenBank收录的HBV基因全序列，基因序列号为AY123041。采用Premier 6.0引物设计软件对HBV病毒基因组保守区序列设计引物，扩增为S区。引物序列如下：BCS:5′-TCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGG-3′(正义，nt1639～1661)BCAS:5′-AGCTTGCCTGAGTGCYGTA-3′(简并引物，其中Y＝CorT，反义，nt1949～1930)。

1.2.8 PCR扩增反应体系

50μl：ddH2O32.5μl，10×TapBuffer5μl，10mMdNTP1μl，25mMMgCl3μl，浓度为10μmol/L的正义、反义引物各2μl，5MU/LTaqDNA聚合酶0.5μl， HBV DNA模板4μl。反应参数为：94℃预变性5分钟，94℃30秒，67℃30秒，72℃45秒1个循环；94℃8秒

第二轮PCR：在Mix反应体系中扩增，其中Mix反应体系中引物为A、B、C型特异性引物。Mix反应体系25μl：包括第一轮反应产物2μlddH2O14.25μl，10×TapBuffer2.5μl，10mMdNTP0.5μl，25mMMgCl1.5μl，浓度为10μmol/L的B2引物和A、B、C型特异性引物各1μl，5MU/L TaqDNA聚合酶0.25μl。反应体系的反应参数为：94℃预变性5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒共30个循环，最后72℃延伸5分钟。(4)琼脂糖电泳取5μl第二轮PCR的产物分别加2μ l6× LoadingDye混合在1.5%琼脂糖(已加EB 5μl/100ml)上样，同时加入低分子量Marker (DGL2000)对照，80V 30分钟进行电泳后切取目的片段区域胶块进行纯化回收，送生工测序。

第1次PCR(外引物)

P1 5′-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3′ (nt2823-2845通用，正义)

S1-2 5′-CGAACCACTGAACAAATGGC-3′ (nt685-704通用，反义)

第2次PCR(内引物)

Mix体系

B25′-GGCTCCAGTTCAGGAACAGT-3′(nt67-86A-C型特异，正义)

BA1R 5′-CTCGCGGAGATTGACGAGATGT-3′(nt113-134A型特异，反义)

BB1R5′-CAGGTTGGTGAGTGACTGGAGA-3′(nt324-345B型特异，反义)

BC1R5′-GGTCCTAGGAATCCTGATGTTG-3′(nt165-186C型特异，反义)

1.2.8 基因测序

将PCR产物电泳后用凝胶电泳分析系统照相，PCR扩增产物长度为311bp(见图2)。停药后HBV DNA阳性血清共110份(包括部分应答和无应答的B、C基因型患者)，进行扩增后，送上海生工生物有限公司进行正义序列测定，测序结果采用Pubmed的工具分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)判断基因型。

1.2.9 统计学方法

采用 SPSS 22.0 统计学软件进行分析。计数资料采用百分比( n% ) 表示，采用卡方进行检验。

2、实验结果

2.1、测序结果

如：取1例湿热中阻型HBV阳性患者阳性血清采用多引物对巢式PCR法检测HBV基因型，该例HBV基因型正义序列测定结果如下：

（部分图）

导出序列：TAAGCCCAAAAGACCCACAATTCGTTGACATACTTTCCAATCAATAGGCCTGTTTACAGGAAGTTTCCTAAAACACATTTTGATTTTTTGCACAATATGTTCCTGTGGCAATGTGCCCCAACTCCCAATTACATATCCCATGAAGTTAAGGGAATATCCCCATCGTTTTGTTTTGTGAGGGTTTAAATGTGTACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGTAACAGCGGTATAAAGGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGGCCCCCAAAACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAGACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCAAGAGAAACGGACTGAGGCCCACTCCCATAGGTACTTTGCGAAAGCCCAAGATGATGGGATGGGAATACAGGTGCAGTTTCCGTCCGTAGGTTTTGTACAGCAACATGAGGGAAACATAGAGGTTCCTTGAGCAGGAGCTGTGCAGGTTTTGCATGGTCCGGTGCTGGTTGTTGATGATCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAACCAGGACAAATTGGAGGACAACAGGTTGGTGAGTGACTGGAGATTTGGGACTGCGAATTTTGGCCAAGATACACGGGTGTTCCCCCTAGAAAATTGAGAGAAGTC

2.2、比对结果

上例测序结果采用Pubmed的工具分析判断基因型：

基因型为：B

2.3结果

2. 1各组基因型分布特点  对中医辨证分型的五组患者进行HBV基因型检测，其中B基因型79例，C基因型30例，B&C型基因型1例，各组HBV基因型分布见表1。

表1  HBV基因型与中医辨证分型的关系［n( %)］

注：χ2 =20.673，P＜0. 01 ，组间具有显著的统计学差异，列联系数为0.398

结果分析：

   HBV的基因型与临床的辩证分型具有相关性（列联系数C=0.389，P＜0. 01），其中湿热中阻90.24%（37/41）、肝郁脾虚85.19%(23/27)、脾肾阳虚61.90%（13/21）主要以B基因型为主，瘀血阻络55.56%(5/9)则以C基因型为主，结果见下表。

列联系数C=(χ2 /(χ2+n))^0.5

3讨论      

基因型是指根据不同个体基因序列之间的规律性差异而分成的不同类型，用来描述基因本身的特征。HBV基因型呈明显的地域性分布。B和C型主要分布在亚洲及远东地区，我国以A, B, C, D 4个基因型较为常见，北方地区以C基因型流行为主，而南方B基因型比例偏高。C型发展致CHB和肝细胞癌所占百分比显著高于B型^[4-8]中医辨证论治是治疗CHB的主要方法。中医证型是运用传统中医学理论，对临床望、闻、问、切四诊所得资料进行归纳分析、辨证施治的依据，不同辨证分型与肝炎病情进展有一定相关性^[9]。我们推测HBV基因型与中医证型之间可能存在一定联系。

本研究结果显示，梧州地区慢乙肝患者HBV基因型以B型为主，其次为C型，发现有1例B&C型HBV在慢乙肝的五个中医证型中，湿热中阻型及肝郁脾虚型均以B基因型为主，提示B基因型可能与疾病的活动有关，而疾病的活动可能与中医的湿热偏盛、肝失疏泄有关，病因以饮食不节、七情所伤多见；而在脾肾阳虚及瘀血阻络的证型中，则以C基因型为主，可能是由于C基因型HBV感染是肝硬化及肝细胞癌发生的相关独立因子^[10]，可能是由于C基因型更容易导致乙肝的慢性化，与中医学湿为阴虚、易损伤阳气、阻滞气机、气滞血瘀、病势缠绵相一致。

纵观本研究分析结果，我们发现HBV基因型与中医证型之间有一定相关性，HBV基因型与部分中医证型有相关性，目前对于HBV B基因型患者主要表现为湿热偏盛、肝失疏泄、脾肾阳虚，而相对来讲，HBV C基因型患者湿邪偏盛、气滞血瘀，正确认识这些主客观辨证信息之间存在的内在联系，在以临床表现进行中医辨证施治的基础上，基因型与中医辨证分型的关系也是用药的参考依据，但不是与所有中医证型都有相关性，因此临床对于不同HBV基因型的CHB患者，仍应根据临床表现进行中医辨证施治为主，以基因型为辅。临证时若发现患者出现瘀血阻络表现，尤其是基因C型患者一旦发现瘀血阻络，遣方用药要在扶正固本的同时，注重活血化瘀通络，改善肝脏微循环，防止病变向肝硬化方向进展。将来，我们还应就这一推论进行更加深入的探讨。

参考文献

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[基金项目] 广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题(任务书编号：GZPT1257)

[作者单位] 543002 梧州，广西，梧州市中医医院，肝病重点专科(文黛薇、胡展瑞、莫湘、黄大荣、邓燕玲、廖民霞等)

[作者]文黛薇 [通讯作者]胡展瑞